Completo

Introducción

El diagnóstico oportuno y preciso de las bacterias gram negativas de la cavidad bucal que ocasionan las enfermedades periodontales nos permiten establecer estudios relacionados con alternativas diferentes a los tratamientos convencionales, como pueden ser principalmente la elaboración de vacunas para el control de estas bacterias, ya que existen varios métodos para la identificación de bacterias en la cavidad bucal, sin embargo estos no son tan exactos ni precisos como se necesita en la actualidad, por lo que la identificación de las bacterias del complejo rojo (Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Fusobacterium nucleatum), mediante la técnica de PCR , el cual nos permitirá conocer con exactitud cuáles son las bacterias causantes de la enfermedad periodontal y determinar cuáles son las que causan mayor daño a las estructuras del periodonto. La periodontitis como enfermedad periodontal, se caracteriza por la pérdida del aparato de inserción periodontal de los dientes. Este proceso incluye varias entidades que se manifiestan mediante diferentes presentaciones clínicas y mecanismos patogénicos. Se considera una enfermedad infecciosa de origen bacteriano, habiéndose descrito en la literatura más de 300 patógenos posiblemente relacionados con la destrucción periodontal.28,29 Las infecciones periodontales producen ciertas bacterias provenientes de la placa subgingival.31 Las bacterias anaerobias Gram negativas más importantes y prevalentes en el área subgingival son el Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa), Porphyromonas gingivalis (Pg), Prevotella intermedia (Pi) y Tannerella forsythensis (Tf).32Actinobacillus actinomycetemcomitans, este es el miembro más importante del género Actinobacillus que forma parte de la microbiota bucal. Las principales bacterias asociadas a la periodontitis crónica son Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola y Tannerella forsythia mientras que Actinobacillus actinomycetemcomitans se ha asociado principalmente a la periodontitis agresiva. Otro microorganismo clave en el desarrollo de la enfermedad es Fusobacterium nucleatum, el cual tiene la capacidad de co-agregarse con los patógenos periodontales y así facilitar su colonización.Entre los métodos de diagnóstico bacteriológico disponible el más importante es el PCR, que nos permite identificar especies que eran raras o no detectables por medio de cultivo, una técnica rápida y precisa para la detección de secuencias específicas de DNA bacteriano en una muestra.52, 53Esta técnica consiste en el aislamiento del ADN, y posteriormente en la separación de sus hebras complementarias mediante un aumento de la temperatura que servirán como molde para la secuencia de nucleótidos nuevos in vitro. La amplificación de ADN continúa gracias a la polimerasa, la cual requiere un “primer” u oligonucleótido que corresponderá al inicio de la cadena que se amplificará. Un segundo “primer” se situará en el lado opuesto de la cadena cuando ésta alcance la longitud que se requiere. Ésta amplificación puede repetirse varias veces, cada amplificación se denomina ciclo. A lo largo de todo el ciclo la temperatura es crucial para la desnaturalización y la estabilidad de la hibridación.

Metodología

El tipo de estudio fue, experimental, longitudinal y prospectivo; se tomaron las muestras en pobladores de comunidades indígenas Tepehuanos, de la zona norte del estado de Nayarit; los cuales viven en caseríos y comunidades aisladas por lo que tiene escaso contacto con la población mestiza de la zona. Se realizó la elaboración de los medios de cultivos de bacterias, Agar Sal y Manitol, Agar Eosina- Azul de Metileno (EMB), Agar Bilis, Agar Chocolate, Agar Hemina Menadiona Vitamina K, Agar sangre. A cada paciente seleccionado para el estudio por medio de los criterios de inclusión, se les tomo muestras de placa dentobacteriana subgingival, en piezas dentales con lesiones que no presentaron comunicación pulpar; con la ayuda de puntas de papel estériles del no. 30 y curetas estériles, de los 3 sitios más profundos de la bolsa periodontal mayor a 4 mm al sondaje, las muestras se colocaron en tubos Eppendorf en medio de Stuart y se mantuvieron en congelación a -40ªC para ser procesadas dentro de las primeras 24 horas de almacenamiento. Posteriormente las muestras se sembraron en los medios ya mencionados anteriormente, mediante la técnica de siembra por estría en placa. Se encubaron en una jarra de anaerobiosis por 72 horas con una temperatura de 37ªC. Para su identificación se realizó la Tinción de Gram, utilizando un MicroScan WalkAway 96 Plus. Después de obtener resultados de las muestras se extrajo el DNA. Para realizar el análisis por PCR se utilizó el kit Gen Elute Bacterial Genomic (Sigma-Aldrich), primero se lavó con 100 UL de agua destilada estéril con el fin de desprender las bacterias para la liberación del material genético, la suspensión bacteriana se alisar por desnaturalización a 100ºC durante 10 min. En cada muestra se analizó por separado la presencia de los patógenos periodontales F. nucleatum (Fn) P. gingivalis (Pg) T. denticola (Td) T forsythia (Tf) y A. actinomycetemcomitans (Aa). Para la identificación de cada bacteria se amplifico un fragmento del 16S rDNA. La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen final de 20 Ul. Las concentraciones de cada componente serán 0.5U de Gotaq Flexi DNA Polymerase (Promega, USA) 1.5 mM MgCI2, 2mM de cada dioxinucleosido trifosfato (Dntp), 1 Um de cada partidor y 0.5 ug de DNA. Todas las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador Multigene mini. El programa PCR utilizado fue por: desnaturalización inicial por 10 min a 94ºC, 35 ciclos de 94º por 30 segs, 55ºc por 30 segs y 72ºC por 30 segs, y una extensión final a 72ºC durante 10 min. Los productos fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 2% y visualizados por tinción con bromuro de etidio, con la utilización de un transiluminador analytikjena USA. 

Resultados

El tamaño de muestra obtenido fue de 60 pacientes con dos muestras a cada uno; en los diferentes medios de cultivo se identificaron bacterias anaerobias, principalmente del grupo de streptococcus mitis/oralis y staphylococcus todos patógenos. (Tabla 1) Al realizar el estudio con PCR, se encontraron las siguientes bacterias Gram negativas: Treponema Denticola, 10, P=.333, Tonarella Forsythensis 4, P=.133, y Porphyromonas gingivalis 16, P= .5 (Tabla 2) Y del grupo de las bacterias anaerobias resalta la presencia de Candida, la cual se condidera cómo pátogena. (Tabla 3) Es importante destacar que Porphyromonas gingivalis se encontró en las diferentes profundidades de sondaje. La zona más afectada fue la zona vestibular de las piezas molares superiores e inferiores.

Conclusiones

La bacteria que se más se identifico fue Porphyromonas gingivalis; además Existe una asociación entre las bacterias encontradas y las lesiones periodontales; encontrándose en lesiones o diagnósticos diferentes; sin embargo la presencia de las 3 bacterias juntas sólo se presentó en 9 P=.30

Palabras clave: bacterias Gram negativas técnica de PCR periodontitis

2022-10-29   |   1,862 visitas   |   Evalua este artículo 0 valoraciones

Vol. 16 Núm.1. Enero-Junio 2021 Pags. 105-108 Rev Invest Cien Sal 2021; 16(1)