Resumen

La Proteina quinasa A (PKA) de S.cerevisiae posee una única subunidad regulatoria (BCY-1) y tres subunidades catalíticas (TPK1,TPK2,TPK3). El camino de transducción de señales de PKA en levaduras posee un rol importante en el control del metabolismo, en particular sobre enzimas del metabolismo de hidratos de carbono y lípidos. Nuestro objetivo fue identificar sustratos potenciales de PKA. Por análisis de espectrometría de masa de digestos trípticos (MALDI) de proteínas co-inmunoprecipitadas y fosforiladas por Tpk1, identificamos dos sustratos: Piruvato quinasas 1 y 2 (Pyk1 y Pyk2). Proteínas de fusión GST-Pyk1 y GST-Pyk2 fueron fosforiladas por subunidad C de PKA corazón bovino y Tpk1 in vitro. Subunidad C de corazón bovino fosforiló Pyk1 con una estequiometría consistente con un sitio de fosforilación por subunidad de Pyk1. La constante de especificidad (Kcat/Km) para Pyk1 y Pyk2 resultaron 10 veces menores que la del kemptido. La fosforilación in vitro usando extractos crudos de cepas wt y tpk1w1 demostraron que la fosforilación de Pyk1 y Pyk2 es Tpk1 dependiente. La fosforilación in vivo de GST-Pyk1 y GST-Pyk2 usando células wt y tpk1w1 metabólicamente marcadas con 32P indicó también que esta fosforilación es Tpk1 dependiente. Estos resultados indican que las isoformas de Pyk son sustratos de PKA en S.cerevisiae.

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2007-01-25   |   1,839 visitas   |   1 valoraciones

Vol. 2 Núm.1. Abril 2003 Pags. Qviva 2003; 2(1)